Métodos para detección de enterotoxinas

"El uso del método biológico es importante para la identificación de nuevos tipos de enterotoxinas y para la investigación de su toxicidad en estado total o parcialmente purificado.39

• Dolman y sus colaboradores utilizaron la inyección intraperitonial en gatos pequeños. El objetivo era demostrar la actividad biológica de filtrados obtenidos a partir de cultivos de Staphylococcus aureus aislados de alimentos.12

Hammon aplicó la inyección intravenosa en gatos jóvenes para la demostración de la actividad de toxinas purificadas.18

• Surgalla y sus colaboradores utilizaron la prueba de alimentación de monos rhesus jóvenes, para comprobar el efecto de toxinas purificadas o sometidas a diversos tratamientos.41

• Denny, Bohrer, Casman y Bennett publicaron que, para evitar interferencias cuando las toxinas son inyectadas intravenosamente, es necesario inactivar otras sustancias biológicamente activas, ya sea con tripsina o pancreatina.7,9

La alimentación de monos jóvenes (preferentemente rhesus, aunque se han utilizado también monos cynomolgus), es el ensayo biológico más confiable para poner en evidencia a las enterotoxinas. Esto se debe a que son las únicas sustancias producidas por los estafilococos que causan emesis cuando se administran por vía oral. El ensayo se hace a través de la administración de soluciones de las enterotoxinas (50 mL) a monos de 2 a 3 kg., por medio de un catéter. Se los observa durante 5 horas para advertir si se presenta emesis y se acepta como reacción positiva4 una respuesta en al menos dos primates.

Existen dos desventajas que limitan el uso de estos animales como una prueba de rutina: el costo y la resistencia a las enterotoxinas4.

Métodos serológicos

Las pruebas más específicas y sensibles para las enterotoxinas estafilocócicas se basan en su reacción con anticuerpos específicos. Toda la información disponible indica que estas reacciones se correlacionan con la actividad biológica.1,4,24

• Bergdoll, Hall, Read y sus colaboradores adaptaron la prueba de difusión en gel en tubo para la determinación de enterotoxinas. El límite de la sensibilidad de esta prueba es de 1 a 2 mg de enterotoxina por mililitro, lo que la hace inadecuada para la demostración de las pequeñas cantidades generalmente encontradas en los alimentos.4, 31 Bergdoll y colaboradores utilizaron el método de Ouchterlony con algunas modificaciones. Demostraron de 5 a 10mg de enterotoxina por mL.4

Una reforma al método de Ouchterlony, conocida como Óptima Sensibilidad en Placa (OSP), da una sensibilidad de 0.5 mg por mL y es muy útil para determinar la enterotoxigenicidad de cepas aisladas de alimentos.4

• Casman, Bennett, Hall y los colaboradores usaron la técnica de microplaca, que es la prueba más sensible de las técnicas de doble difusión en gel. La emplearon para investigar la enterotoxigenicidad de cepas aisladas de alimentos. Por medio de este procedimiento se puede demostrar la presencia de 0.1 mg, o menos, por mL. Esta ha sido la técnica oficial en el ámbito internacional para probar la existencia de enterotoxinas en alimentos.7

• El método propuesto por Sokary y Amozi en 1989, denominado difusión radial simple, permite la realización de 50 o más pruebas a la vez. Tiene una desventaja: requiere de un volumen grande de antitoxinas.36

• Morse y Mah emplearon la técnica de hemaglutinación y utilizaron ensayos de inhibición de la hemaglutinación. La sensibilidad de este método es de 1.5 ng de enterotoxina por mL, equivalente a demostrar 0.1 mg por cien gramos de alimento. La desventaja de este procedimiento es que requiere tratamientos muy complicados para eliminar la aglutinación no específica.4,5,25

• Collins, Dickie, Jhonson y colaboradores utilizaron radioinmunoensayo en fase sólida para demostrar enterotoxinas en alimentos y en cultivos de Staphylococcus aureus. Esta prueba tiene una sensibilidad de 1 a 10 ng de enterotoxina por mL.8,11,21 • Genigeorgis, Sadler, Stark y Middaugh, utilizaron anticuerpos fluorescentes para demostrar la presencia de enterotoxinas en alimentos. La sensibilidad de esta prueba es de 1 mg por mL y una gran desventaja es la fluorescencia no específica causada por el alimento.17,38

• Gasper y colaboradores propusieron métodos electroforéticos. La sensibilidad de estos métodos es mucho menor que la de la microplaca, motivo por el cual se ha limitado su utilización.16

Métodos de coaglutinación y ELISA

Posteriormente, el interés de los investigadores se ha enfocado a dos métodos más sensibles: coaglutinación y ELISA. Esto se debe a que la detección de EEs en alimentos requiere de métodos más sensibles que los utilizados para demostrar la enterotoxigenicidad de cepas, porque la cantidad de EEs presente en los alimentos involucrados en brotes puede variar considerablemente de menos de 1 ng/gramo de alimento hasta 1 microgramo/gramo.

Los trabajos realizados con varias técnicas de aglutinación indicaron que la Hemaglutinación Pasiva Reversa (RPHA) fue la más adecuada. Sin embargo, la ventaja de su alta sensibilidad se ve limitada por un gran número de reacciones cruzadas no específicas.2 Una alternativa a la técnica anterior es la Aglutinación Pasiva Reversa con partículas de látex (RPLA), la cual tiene una sensibilidad del orden de 0.25 ng/mL.


Existen equipos comerciales con fundamento en esta técnica que han sido evaluados por varios investigadores. Las conclusiones obtenidas fueron contradictorias.30,34,44 La RPLA convencionalmente requiere de 16 horas para obtener los resultados, pero se puede reducir este tiempo a 3 horas usando partículas de látex de alta densidad.15 Aunque se han desarrollado numerosos equipos comerciales que utilizan como fundamento la RPLA, la mayoría de los esfuerzos se han enfocado a las técnicas de ELISA debido a su alta sensibilidad, especificidad y facilidad en su realización.

De las diferentes técnicas de ELISA que existen para la demostración de las EEs en alimentos, la que se ha recomendado y utilizado más ampliamente es la de “sándwich”.2,3,14,23 Las primeras ELISAs para la demostración de EEs usaron anticuerpos policlonales y más tarde recurrieron a los monoclonales.42 Varios estudios comparativos han mostrado que, en ensayos cuantitativos con anticuerpos monoclonales, se ha tenido una mayor exactitud y sensibilidad y las respuestas no específicas fueron menores en relación a los sistemas que usan anticuerpos policlonales. Sin embargo, la recuperación de EEs a partir de extractos de alimentos fue menos eficiente con anticuerpos monoclonales en relación con los policlonales.35

La mayoría de los ELISAs emplean placas de microtitulación de poliestireno, aunque hay algunos sistemas que emplean esferas de ese material recubiertas con anticuerpo. La sensibilidad es considerablemente mayor, del orden de 0.5 a 1.0 ng/g de alimento, pero se pueden presentar interferencias con algunos ingredientes, por lo que se necesita diluir el extracto del alimento con la consecuente disminución en la sensibilidad. Esta prueba no se recomienda para un gran número de muestras porque es más laboriosa.

En el caso de las placas de microtitulación se requiere de un lector de ELISAs para tener resultados más confiables, aunque también se puede leer a simple vista.43

Un número considerable de modificaciones se ha estudiado con el propósito de evitar las interferencias que se presentan con las partículas del alimento.23,37,45 Existen principalmente dos sistemas comerciales: el que utiliza esferas y la placa de microtitulación.14 Los dos equipos son equivalentes en sensibilidad aunque el último es técnicamente más simple. No se puede identificar el tipo de EEs, lo cual es una desventaja para estudios epidemiológicos.

Existen también reportes con buenos resultados donde se utiliza la técnica de inmunoblot.29 Después de que se conoció la secuencia de nucleótidos que codifican para la produccción de las EEs, se han utilizado técnicas de Biología Molecular para la detección de cepas enterotoxigénicas, ya que la presencia del gen-enterotoxigénico muestra una buena correlación con la producción de EEs.13,20,26,27,40

Recientemente se ha utilizado la técnica de PCR para investigar la presencia del gen que codifica para la producción de EEs, a partir de cepas aisladas de alimentos y en aquellos que están contaminados intencionalmente.22

Los resultados han mostrado la eficiencia de esta prueba para la detección y caracterización de cepas enterotoxigénicas. En comparación con otros métodos, puede investigarse un gran número de ellas al mismo tiempo, por lo que en el diagnóstico de BlAs esta técnica podría ser de gran utilidad. Sin embargo, se requiere una mayor investigación en este área.28

Extracción de las EEs a partir de alimentos

Si bien es cierto que se experimentó un avance en las técnicas para la demostración de la enterotoxigenicidad de cepas y de la presencia de las EEs directamente de extractos de alimentos, la extracción de las EEs a partir de éstos aún es un problema


considerable.43 Un gran número de métodos se han propuesto. Todos incluyen procedimientos laboriosos de extracción y de concentración y el uso de la técnica de microplaca para la demostración de la enterotoxina. Con estos métodos se puede demostrar de 0.1 a 0.2 mg de enterotoxina en 100 g de alimento o en 250-500 mL de leche.4

Casman y Bennett propusieron un método de extracción para las EEs con soluciones de cloruro de sodio, concentración con polietilénglicol, extracción con cloroformo y cromatografía en carboximetil celulosa.7

Reiser y colaboradores, propusieron un método en el que se sustituye la carboximetil celulosa por una resina de intercambio iónico (amberlita CG-50). Se adiciona tripsina en el paso final para reducir la interferencia de contaminantes proteicos procedentes del extracto del alimento, en la técnica de microplaca. En este procedimiento se usan normalmente 100 g de alimento o 250-500 mL de líquido. Del extracto concentrado del alimento quedan de 2 a 5 mL que se liofilizan. Después, este liofilizado se resuspende con 0.1 a 0.2 mL de tripsina para llevar a cabo la prueba de microplaca. Este método no es fácil de realizar y requiere de mucha experiencia para lograr la sensibilidad máxima. El resultado se obtiene en tres días, si la microplaca se incuba a 37oC.32

La limitación de esta técnica y en general de todos los métodos serológicos, es la indisponibilidad comercial de los antisueros específicos y de las enterotoxinas purificadas. Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones realizadas con antitoxinas y toxinas purificadas se hicieron con la colaboración de varios especialistas como Casman, Bennett y Bergdoll.

Debido a la dificultad en los procesos de extracción, purificación y concentración para la obtención de las EE de los alimentos, se intentó utilizar un método simple de extracción combinado con otro altamente sensible para la detección de las EE, lo cual resultó satisfactorio en algunas circunstancias. Sin embargo, deben buscarse alternativas a los procesos utilizados a la fecha.43

La extracción inicial generalmente involucra homogeneización en un regulador o en agua destilada, seguida de una centrifugación a baja velocidad para remover algunas partículas del alimento. El regulador de fosfatos salinos (PBS, regulador de fosfatos 0.07 mol/l NaC1, pH 7.2) es utilizado para este fin.32 Según el tipo de alimento, se pueden adicionar en este paso Tween 20 u otras sustancias para evitar algunas interferencias.34 Cuando se utiliza agua destilada para la extracción, es necesario ajustar el pH a 4.5 antes de centrifugar y después debe volverse a ajustar a 7.5.32

Purificación y concentración de enterotoxinas

Dos métodos de purificación han sido reconocidos para uso rutinario. En ambos se recurrió a la utilización de resinas de intercambio iónico (Casman7 y Bergdoll6). El primero involucra una cromatografía en columna con el uso de carboximetil celulosa y el segundo se concreta mediante la adsorción de la enterotoxina a través de amberlita CG-50.32

Los dos métodos tienen una eficiencia similar pero el de adsorción es más fácil, rápido y el más utilizado. La resina debe activarse previamente, lo cual es un proceso laborioso, sobre todo si se trata de resina de reuso.

Posteriormente, se han utilizado otros materiales como sefarosa y algunos colorantes mediante cromatografía de afinidad, con los cuales se han obtenido porcentajes elevados de recuperación de las EE, tanto de cultivos provenientes de cepas puras como de extractos de alimentos.10,33 Es necesario eliminar la grasa de los alimentos para evitar interferencias. Para tal fin se utiliza cloroformo, el cual puede removerse con un embudo de separación.

Con respecto a la concentración, en general se han utilizado tres procedimientos: liofilización, diálisis (generalmente contra polietilenglicol) y ultrafiltración (filtro Minicon, Amicon Ltd.). Con el último método la pérdida de las EE es mínima, en comparación con los dos primeros.

Para la prevención y el control de las ETAs es preciso evitar el ingreso del microorganismo al alimento, detener su multiplicación en el mismo y destruir al microorganismo patógeno o su toxina.

En el caso específico de las intoxicaciones estafilocócicas, se pueden aplicar los principios detallados a continuación.1,4,24

Prevención de la contaminación

Es imposible evitar que los alimentos se contaminen con Staphylococcus aureus debido a la amplia distribución del microorganismo en el ambiente, pero es posible evitar su ingreso cuando se aplican ciertas medidas higiénicas.

Los humanos son el principal reservorio del microorganismo, por lo que la salud, la higiene y los hábitos de los manejadores de alimentos influyen en el nivel de contaminación.

• A la gente que no respeta las normas de higiene no se le debe permitir la manipulación de alimentos.

• Las personas con sinusitis, catarro, faringitis, acné, furúnculos y heridas en las manos, son portadoras de Staphylococcus aureus, por lo que no deben manejar los alimentos. Se les deberá transferir a áreas de producción o de manejo de alimentos que no sean tan peligrosas.1,4 En cuanto a los portadores nasales de este microorganismo en los hospitales, Hunter y Baker propusieron la utilización de un antibiótico en aerosol y lograron eliminarlo en el 89% de las personas tratadas.19

• El ganado bovino es una fuente muy importante de contaminación de la leche. Se debe prevenir la mastitis en las vacas y los veterinarios deben reforzar la vigilancia en los establos para que no sean ordeñados los animales con procesos infecciosos de ese tipo.

• El equipo y los utensilios contaminados con Staphylococcus aureus deben ser lavados y desinfectados adecuadamente.1,4,24
Destrucción del microorganismo La principal medida de control para evitar el desarrollo y producción de enterotoxinas es mantener al alimento a temperaturas por debajo de 4oC o por encima de 46oC. La producción de la enterotoxina ocurre entre 10oC y 45oC, aunque la mayor cantidad se produce entre los 33oC y 38oC.1, 4

Es obvio que a temperatura ambiente o a la que se sirve un alimento para ser consumido, este microorganismo puede crecer bastante bien, por lo que los alimentos perecederos no deben permanecer a esas temperaturas. Las carnes y sus productos, así como la leche y sus derivados, deben conservarse refrigerados. En algunos alimentos, como las salchichas y el salami, el pH bajo y la abundancia de flora fermentativa impiden el desarrollo de Staphylococcus aureus.1

La actividad de agua (aw) es otro factor que se puede controlar para evitar el desarrollo del microorganismo. El valor mínimo de aw para el crecimiento de Staphylococcus aureus es de 0.83 a 0.86. La adición de solutos (principalmente sal) o la deshidratación de los alimentos pueden provocar una aw menor de 0.83, para evitar el desarrollo del microorganismo y la consecuente producción de enterotoxina, ya que se requieren valores de aw mayores de los que se necesitan para el crecimiento de la bacteria.1 El calor es el principal método empleado para eliminar microorganismos. Aunque puede destruir a la bacteria, si la enterotoxina se ha producido puede persistir en el alimento debido a su termoestabilidad. Por ese motivo, esta técnica no es la más adecuada para eliminarlas.

La temperatura y el tiempo de exposición necesarios para destruir al microorganismo son muy importantes y dependen de factores como:

- la resistencia de la cepa,

- el número de células presentes,

- el tipo de alimento,

- la edad de las células,

- el medio en que se encuentra el microorganismo,

- el pH,

- la aw.


Es relativamente fácil eliminar al Staphylococcus aureus con procesos como la pasteurización o cocción. Sin embargo, al destruir o reducir la biota normal del alimento por el calor, es más peligrosa la recontaminación con el microorganismo, ya que no habrá biota competitiva que inhiba su crecimiento. Si estos alimentos permanecen a la temperatura adecuada para el desarrollo del estafilococo, puede haber producción de enterotoxina y al ser consumido ese alimento es posible la aparición de un brote.1, 4 Destacamos que, tanto los manejadores de alimentos como los consumidores pueden evitar el ingreso del microorganismo, su multiplicación a través de la refrigeración de los alimentos y la aparición de brotes de intoxicación estafilocócica, mediante prácticas higiénicas apropiadas.
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